Justin Chambers a fait sa première apparition à l’écran dans Liberty Heights de Barry Levinson, où il jouait Trey, un jeune WASP désenchanté des beaux quartiers de Baltimore. Venu de la télévision, Chambers débute avec le rôle de Nick Terry dans le feuilleton « Another World » et interprète un délinquant juvénile dans "Swift Justice" avant de tenir son premier rôle vedette dans la série "Unis", dérivée de « New York Undercover ». Suivront notamment : la mini-série « Seasons of Love », avec Rachel Ward et Peter Strauss ; un rôle vedette aux côtés d'Ann-Margret dans la série « Four Corners » ; le pilote Slylark et deux dramatiques du programme Hallmark Hall of Fame : « Harvest of Fire », avec Patty Duke, et « Rose Hill », une des productions les plus populaires jamais diffusées dans ce cadre.
Au cinéma, Justin Chambers a figuré aux génériques d'Un mariage trop parfait d'Adam Shankman, avec Jennifer Lopez et Matthew McConaughey, D'Artagnan de Peter Hyams dans le rôle titre, Leo de Mehdi Norowzian, du court métrage For Which It Stands de Kevin Shahinian, Southern Belles de Paul S. Myers et Brennan Shroff, ainsi que de The Zodiac d'Alexander Bulkley dans le rôle de l'inspecteur Inspector Matt Parish.